EXPERIMENTÁLNÍ  LÉČBA  ZHOUBNÉHO  MELANOMU POMOCÍ  ISCHEMIZACE (DEVITALIZACE)

 

Klinická onkologie 1/95

 

K. Fortýn1, V. Hruban2, V. Horák3, J. Tichý4

 

CHIRURGICKÉ ODD., NEMOCNICE, 513 31 SEMILY1

KATEDRA GENETIKY A OBEC. ZOOTECHNIKY. VŠZ, 16521 PRAHA 622

ÚSTAV ŽIVOČ. FYZIOLOGIE A GENETIKY AV ČR, 27721 LIBĚCHOV3

PATOLOGICKO-ANATOMICKÉ ODD., NEMOCNICE, 51101 TURNOV4

 

 

Souhrn:                         

Laboratorní miniaturní prasata s genetickou predispozicí k výskytu maligního melanomu byla využita k pokusné ischemizaci (devaskularizaci, devitalizaci) nádorové tkáně. U sedmi zvířat byly pozorovány mnohočetně primární nádory kůže převážně tuberózně nodulární formy a u čtyř zvířat byly rovněž rozsáhlé metastázy lymfatických uzlin, na játrech, slezině a ledvině a gastrointestinálním traktu. Ischemizace primárních kožních nádorů bylo dosaženo sérií částečně se překrývajících matracových stehů vedených kolem báze nádoru ve tvaru řetězu. Po pečlivém dotažení stehů devaskularizovaný primární nádor nebyl extirpován, ale ponechán in situ. Po nekrotizaci z primárních nádorů zbyla plochá jizevnatá tkáň s depigmentovanými chlupy. Překvapivé byly druhé nebo třetí laparotomické revize (4. - 8. týden), při kterých bylo zaznamenáno vymizení všech orgánových a peritoneálních metastáz. Využití devitalizačního zákroku v klinické praxí je předmětem diskuse.

 

Klíčová slova: maligní melanom, miniprase, ischemizace, devaskularizace, devitalizace, regrese nádoru

 

Summary: Miniature laboratory pigs with a genetic predisposition to malignant melanoma were used in experimental ischemization of the tumor tissue (devascularization, devitalization). Multiple primary skin tumors in seven animals had mostly tuberous nodular form and in four animals were also recorded extensive metastases in lymph nodes, liver, spleen, kidney and gastrointestinal tract. Ischemization of the primary skin tumors was achieved by series of partially overlapping mattress sutures conducted around the tumors base, forming a chain. After careful tightening the sutures, devascularized tumor was not excided but left in situ. Following necrotization process caused disappearance of the tumor and produced flat scar with white depigmented bristles. Second or third laparoscopic revision (at 4 - 8 week) revealed surprisingly regression of all metastases. The use of devitalization procedure in clinical practice is discussed.

 

Key words: malignant melanoma, minipig, ischemization, devascularization, devitalization, tumor regression

 

 

 

 

Úvod

Maligní pigmentové nádory jsou dosud označovány různými názvy: melanoblastom, maligní melanom nebo maligní tumor z névových buněk. Výskyt v humánní patologii byl udáván poměrem 5 případů na 100 000 obyvatel, ale jejich frekvence má vzrůstající tendenci. V některých státech USA byl zaznamenán trojnásobný nárůst (1). Metastázy z maligního melanomu patří mezi nejčastější ze všech druhů neoplazií a prognóza u takovýchto pacientů je krajně nepříznivá (2). Konvenční způsoby chemoterapie nebo radioterapie jsou málo účinné (3), takže chirurgická intervence zůstává hlavní léčebnou metodou (1, 2, 3). Doposud však není jednota v názorech na rozsah excise primárních nádorů (4) ani na léčebnou a profylaktickou excisi regionálních lymfatických uzlin (1, 2). Existuje jen shoda v názoru na radikální excisi vedením její linie ve směru lymfatického spádu dané krajiny. Směrem do hloubi však jedni autoři uznávají excisi po svalovou fascii, druzí doporučují ji také vyjmout. Z hlediska odstranění regionálních lymfatických uzlin jedni již při primární excisi provádí blokovou disekci uzlin, druzí sahají k tomuto výkonu až při výskytu metastáz. Namnoze je doporučována radikalita např. odstraněním uzlin ilických i regionálních. Tyto výkony nejsou často technicky tak snadné, jak by se zdálo, nehledě na vysokou pooperační morbiditu a jejich efekt pro prognózu postiženého pacienta je spíše sporný (3).

 

V  protikladu s běžnými chirurgickými postupy, které prosazují radikální intervenci, na pokusných zvířatech (prasatech) jsme ověřili možnost využití cílené ischemizace (devitalizace) maligních melanomů. Dosažené výsledky dávají předpoklad k využití metody v klinickém experimentu.

 

Materiál a metody

V pokusné sestavě byla sledována skupina 7 laboratorních černě pigmentovaných miniprasat kmene Minnesota, u nichž bylo možné aspexí zjistit výskyt celkem 32 maligních melanomů (od 2 do 7 na jednom zvířeti) a to na krku, trupu i končetinách. Výskyt postižených zvířat v potomstvu jen ze dvou kombinací páření (jeden kanec a dvě prasnice) naznačuje existenci genetické predispozice, která byla popsána již dříve u podobných miniaturních prasat kmene Sinclair (5). Na rozdíl od kmene Sinclair. kde se predispozice jednoduše dědí spolu s haplotypy hlavního histokompatibilního komplexu, u našich prasat je plný projev maligní formy geneticky složitější a je předmětem dalšího pozorování. Na krku bylo pozorováno 9 nádorů, na trupu 13 a na končetinách 10. U 5 zvířat byly pozorovány metastázy v regionálních lymfatických uzlinách (lymphonodi cervicales et inquinales). Orgánové metastázy byly zaznamenány u 4 zvířat ještě na játrech, slezině, ledvině a GIT. Kožní formy v délkové orientaci byly 4 až 12 cm, s prominencí nad povrch od 1 cm do 4 cm. Převážná část nádorů byla tuberonodulární formy. Povrch tumorů silně prominujících nad povrch kůže byl rozpukaně hrbolovitý a místy docházelo k serofibrinózní i serosanguinoletní sekreci z defektů patrně po traumatech z kontaktu s jinými zvířaty. Pokud byl u jiných zvířat nezahrnutých do tohoto pokusu proveden řez nádorem, do hloubi zasahoval po tela subcutanea. Makroskopicky nebily pozorovatelné nápadnější známky infiltrace do fascie a muskulární vrstvy. Všechny tumory byly šedě černé barvy, dobře ohraničené a místy přecházely v sytě černě pigmentované plochy charakteru pigmentových névů, zejména v inguinách a v dolní polovině břišní (obr. 1).

U všech zvířat byla provedena iniciální diagnostická laparotomie („first look“) a s odstupem času, 4 - 8 týdnů po ischemizaci kožních nádorů, byly prováděny druhé, případně třetí laparotomické revize („second look“). Laparotomie a ischemizace primárních nádorů byly uskutečněny v celkové anestézii, a to po premedikaci Atropinem (0,25 až 0,5 mg), po úvodu Rohypnolem (2 mg) a Seduxenem (5 mg) a udržování Narcotanem s O2 v koncentraci 0,5 - 5 % podle potřeby hloubky narkózy. Zjištěné změny jsme protokolárně i fotodokumentací podchytili a doplnili histologickým vyšetřením barvením řezů z parafinových bločků a řezů z kryokatu s použitím hernatoxylinu a barvením podle Fontany a Gömóryho. Vlastní ischemizace mnohočetných primárních nádorů na kůži bylo dosaženo jednoduchou technikou. Zakládána byla série opichů překrývajících se matracových stehů, které byly vedeny kolem nádoru ve formě řetězu od jedné hranice do druhé tak, že stehové vlákno (hedvábí 4 A - 4 C) se ve vzdálenosti 1,5 - 2 cm vracelo novým propichem do blízkostí místa vedení stehu. Směrem do hloubky stehy zasahovaly po tela subcutanea. Po pevném dotažení následovalo zauzlení série stehů. Tím došlo k mírné elevaci nádoru nad povrch, přerušení kontinuity cévního zásobení z podkoží a takto k devitalizaci tumoru cestou ischemizace (devaskularizace). V případě metastáz v regionálních lymfatických uzlinách, které byly zjistitelné palpací, byla provedena povrchová incise, preparace uzliny při zachování hilové oblasti a následovala ligatura nutritivních i lymfatických cév. Uzlina byla ponechána in situ a incise sešita. Orgánové a peritoneální metastázy byly ponechány intaktní, pouze z 1 - 2 metastáz každého orgánu byl excidován malý kousek na histologické, vyšetření.

 

 

VÝSLEDKY

 

Makroskopické pozorování

Ischemizace kožních nádorů a následující nekrotické změny vyvolaly postupnou atrofii tumoru, Jeho zmenšování, až za 4 - 8 týdnů došlo k přeměně v tuhý, deskovitý, plochý útvar šedobílé barvy, zasahující do podkoží. Pokud na této tkáni zůstalo při okrajích řídké ochlupení, rostoucí štětiny byly depigmentované. Okolní kůže a ochlupení mělo zachovalou normální tmavou pigmentaci. Po zániku primárních kožních nádorů překvapivá byla laparotomická revize (second look). Z hojného rozsevu metastáz na játrech, slezině, mesenteriu a dalších částech GIT, zjištěných při první probatorní laparotomii, bylo pozorováno v odstupu 4 - 8 týdnů jejich úplné vymizení. Pokud byla při první revizi po ischemizaci (4 týdny) pozorována ještě nahnědle pigmentovaná ložiska na játrech, při další revizi (7 – 8. týden) byl na játrech normální homogenně zbarvený, hnědě červený parenchym elastické konzistence, bez jakékoli známky melaninové pigmentace. V ostatních částech břišní dutiny v místě metastáz (pokud bylo možné je ještě spolehlivě určit) zbyly malé šedě růžové útvary (kolem 0,5 cm) fibrózního vzhledu, s mírně ztluštělou serózou nad povrchem.

 

Histologické nálezy

V  nádorové melanomové tkáni na kůži před devitalizačním zákrokem byly husté provazcovité útvary melanoblastů táhnoucí se od bazální membrány pod epidermis až do bazálních vrstev retikulární vrstvy koria. Na periferii byly prokazatelné alveolární i trabekulární formace, tvořené hustě nakupenými melanoblasty. Měly okrouhlý tvar se světlými jádry se zřetelnými nukleoly. Místy mezi jednotlivými mebanoblasty byla štěrbinovitá projasnění (známky disjunkce buněk charakteristické pro melanoblasty zejména tam, kde naléhají melanoblasty na cylindrické buňky bazální vrstvy epidermis). Melanin byl v nádorových buňkách hustě nakupen tak, že namnoze nebylo možno jádra buněčná rozeznat. Husté seřazení melanoblastů do pruhovitých, trabekulárních i alveolárních formací kontrastovalo se zbytky kona mezi nimi, kde byly přítomny melanoblasty v menších skupinách i jednotlivé disperzně rozložené. Nápadnější polynukleární infiltráty jsme nepozorovali. Epidermis v místě tumorózních ložisek jevila úplnou desintegraci, koriální papily byly úzké, pokryté jen ztenčelou epidermis. Směrem do periferie tumoru se vracela normální podoba papilární vrstvy kona a kolagenní vazivo bylo fascikulárně uspořádané až po hustou spleť vláken v retikulární vrstvě kona. Tela subcutanea byla ztenčelá a obsahovala jen disperzně lokalizované skupiny melanoblastů (obr. 2) .

Po devitalizaci za 4 - 8 týdnů tvořilo korium tuhý pruh jizevnatě hyalinně změněné vazivové tkáně bez přítomnosti melanoblastů. Koriurn bylo bez papil protáhle ztenčelé a naléhalo na subkutánní řídké vazivo. Nádorové buňky nebyly prokazatelné.

Lymfatické uzliny zasažené masivními metastázami melanoblastomu byly před devitalizací zcela prostoupeny velkým množstvím melanoblastů hustě nakupených, takže strukturu lymfonodů nebylo možno podrobněji rozeznat, pouze fibrózní pouzdro uzliny a řídké pojivo v okolí. Po devitalizaci uzliny (za 4 týdny) zbyl z uzlin pouze fibrózní útvar sotva rozeznatelný, v podkoží bez známek nádorových buněk.

Játra v místě metastáz pod fibrózním pouzdrem obsahovala shluky melanoblastů, které se od jaterního okraje propagovaly do interlobulárního pojiva. Místy byly melanoblasty disperzně lokalizované v portobiliárních Kiernanových prostorech. Směrem do centra jaterního parenchymu známky metastáz chyběly. Po devitalizačním zákroku primárních nádorů byla nalezena fibrotická ložiska s atypickými hepatocyty bez přítomnosti melanoblastů. Podobný obraz, tzn. fibrotické změny a vymizení nádorových buněk, byl pozorován v případě slezinných, ledvinových metastáz a na GIT.

Žádné z pokusných zvířat neuhynulo. Po provedené devitalizaci se stav dekrepidních zvířat nápadně zlepšil, začala jevit zvýšený zájem o potravu, u dvou silně kachektických zvířat nastal výrazný nárůst hmotnosti. Žádná recidiva nebyla pozorována. Jedna dlouhodobě pozorovaná vyléčená prasnice porodila vrh selat s výskytem melanomu, u dvou zvířat je v době přípravy publikace (stáří 3 měsíce) pozorovatelný neoplastický zvrat.

 

Diskuse

Vzhledem k narůstající frekvenci výskytu maligních melanomů u člověka výzkumné snahy jejich diagnostiky a léčení v současně době zintensivněly. I při stanovení pozitivní diagnózy melanoblastomu a při provedení blokové disekce regionálních uzlin je stále velkou otázkou, jaká bude prognóza pro pacienta. Všechny možně způsoby doplňující postchirurgické péče ukazují na snahy pacientovi pomoci, avšak jejich význam a nízký léčebný efekt jsou dostatečně známy. Kde se objevují metastázy v regionálních uzlinách, i seberozsáhlejší chirurgický výkon se zpravidla nesetká s účinnou odezvou a fatální konec je bohužel neodvratný. Z tohoto hlediska jsme si dovolili upozornit na naše zkušenosti z experimentů u doposud méně známě „melanoblastomové choroby“ (multiplicita primárních melanoblastomů na genetickém podkladě). Z našich experimentů je zvláště pozoruhodná spontánní regrese metastáz po nekrotizaci primárních nádorů. Za současného stavu poznání můžeme jen spekulovat o mechanismu indukovaného zániku tumorů.

Jednoduchý chirurgický zákrok typu devitalizace s následnou nekrotizací tumoru snad vyvolal stimulaci makrofágů a dalších buněk imunitního systému, které vytvořily odpověď vedoucí k vymizení nejen melanoblastomů ve všech lokalitách, ale i likvidaci metastáz v uzlinách i na orgánech. Toto spekulativní vysvětleni má určitou logiku v souvislostí s produkcí některých interleukinů (IL-2) nebo faktoru způsobujícího nekrózu tumorů (TNF-α), případně účinkem interferonů, které jsou produkovány stimulovanými makrofágy a dalšími buňkami imunitního systému infiltrujícími tumory u člověka a laboratorních zvířat (6). I když je ještě mnoho nejasného v pochopení regrese tumorů, která je mediovaná imunitní odpovědí, uvedené cytokiny jsou ověřovány pro terapeutické použití (7). Možnosti využití imunoterapie maligních melanomů jsou posíleny nedávnými objevy o aktivaci reaktivity cytolytických T lymfocytů s buňkami melanomu, a to v souvislosti s tvorbou molekulárních komplexů HLA antigenů třídy I s proteinem MAGE-1, který je produktem genu aktivovaného v melanomových buňkách (8). V našem experimentu můžeme opět spekulovat o aktivaci T cytotoxických lymfocytů následkem molekulárních změn, které nastanou na buňkách melanomu po ischémii a následující nekróze. I když ještě neznáme podrobně biologické vlastnosti prasečího me1anoblastomu a mechanismus jeho regrese, ukazuje se, že jde o cenný experimentální model s určitými analogiemi s lidskými formami tohoto nádoru. Protože využití specifické imunoterapie maligních melanomů u člověka není dořešeno a genové terapie jsou ještě vzdálenou perspektivou (9), bylo by možné ošetřit devitalizační technikou infaustní případy v klinickém experimentu? Devitalizační technika již byla využita přinejmenším jako paliativní zákrok v onkochirurgii GIT a její výsledky se ukázaly jako příznivé (10).

 

 

Poděkování

Autoři děkuji vedení pobočky České pojišťovny, a. s. v Mělníku za finanční pomoc, kterou byla hrazena část nákladů na experimenty a chov cenných pokusných zvířat.

 

 

Literatura

 

1.        Colt, D. G., Brennan, M. F.: Current management of malignant melanoma. Surgery 113: 128 - 129, 1993.

2.        Wang, J. H.: Skinner, K. A., Kim, K. A., Foshag, L. J.,Morton D. L.: The role of surgery in the treatment of nonregionally recurrent melanoma. Surgery 113: 389 - 394. 1993.

3.        Fine, L G.: Malignant melanoma. Report of a meeting of physicians and scientist. University College London Medical School. Lancet 340: 948 - 951, 1992.

4.        Timmons, M. J.: Malignant melanoma excision margins: making a choice. Lancet 340: 1393 - 1395, 1992.

5.        Tissot, R G, Beattie, C W., Amoss, M. S.: Inheritance of Sinclair swine cutaneous malignant melanoma. Canc. Res, 47: 5542 - 5545, 1987.

6.        Lotzová, E.: Role of human circulating and tumor infiltrating lymphocytes in cancer defense and treatment. Nat. Immun. Cell Growth Regul., 9: 253 - 264, 1990.

7.        Rosenberg, S. A.: The immunotherapy and gene therapy of cancer. J. Clin. Oncol. 10: 180 - 199, 1992.

8.        Boon, T.: Toward a genetic analysis of tumor rejection antigens. Ody. Canc. Res. 58: 179 - 210, 1992.

9.        Boon, T.: Teaching the immune system to fight cancer. Sdi. Am., 268: 32 - 39, 1993.

10.     Fortýn, K., Hruban, V‚ Hradecký, J., Tichý, J.: Ischemizace zhoubných nádorů gastrointestinálního traktu jako pokus o paliativní léčebný zákrok v onkochirurgii. Klin. Onkol., 2: 7—10, 1989.

 

 

 

POZNÁMKA REDAKCE

 

Práci otiskujeme po dlouhodobější debatě o její vhodnosti. Domníváme se totiž, že i přes některé kontroverzní body se jedná o velmi zajímavý fenomén, který ovšem nelze v žádném případě mechanicky přenášet do lidské kliniky. Jak  ukazují i poslední práce o prasatech Sinclair, jedná se zřejmě o biologicky zcela jinou chorobu nežli lidský melanom, i při prakticky shodné morfologii.

V. Fatt

 

Klinická onkologie 1/95

 

 

 

*

*

*